Molekulêre genetiese metode van ondersoek

Om variante in die struktuur van DNA te bestudeer en te identifiseer, word 'n molekulêre genetiese metode gebruik. Vir elke DNA-streek wat ondersoek word, is die streek 'n chromosoom, 'n geen of 'n allel, die metodes verskil. Die kern van elke molekulêre-genetiese metode bevat 'n mate van manipulasie van RNA en DNA. Al hierdie metodes is uiters kompleks, sonder dat laboratorium toestande uitgevoer kan word, en die personeel moet hoogs gekwalifiseerd wees. Hierdie werk word in verskeie stadiums uitgevoer.

stadiums

Eerstens moet monsters van RNA of DNA verkry word. Hier kan die molekulêre genetiese metode toegepas word op feitlik enige materiaal: 'n druppel bloed, leukosiete, 'n kultuur van fibroblaste, 'n slymvlies (skraap), selfs haarbolletjies. - DNA kan verkry word uit enige monster. Dit is geskik vir die toepassing van enige molekulêre genetiese metode en hul verskillende variante, en reeds toegekende DNA word lankal in die yskas gestoor. Die tweede fase is gewy aan die ophoping van nodige fragmente (amplifikasie) van DNA, om te verseker dat dit die kettingpolymeerase-reaksie in vitro help (in vitro, sonder die deelname van 'n lewende organisme). As gevolg hiervan vermenigvuldig die gekose DNA-fragment met hierdie kettingreaksie, en die hoeveelheid DNA neem letterlik 'n miljoen keer toe.

Die derde fase van molekulêre genetiese metodes van ondersoek is die beperking van vermenigvuldigde DNA (dit is fragmentasie, skeur of sny). Beperking word uitgevoer met behulp van poliakrylamied- of agarose-gelelektroforese. Hierdie molekulêre genetiese metode om DNA te bestudeer, laat elke fragment toe om 'n sekere posisie in die gel te beklee. Daarna word die gel behandel met etidiumbromied, wat in DNA kan bind, ultraviolet bestraling word uitgevoer, waarna die luminisensie gebiede waargeneem kan word. Molekulêre genetiese metodes van diagnose is uiteenlopend en talryk, maar die eerste twee stadiums is tipies vir almal. Maar om DNA fragmente te identifiseer, kan die gel met baie ander bestaande metodes gekleur word.

spesies

Die mees direkte en wydverspreide metodes vir die opsporing van miobakterieë sluit in die bogenoemde molekulêre genetiese metode van DNA-navorsing. Die essensie daarvan is om in die diagnostiese materiaal spesifieke fragmente van die ketting van DNA-patogene te identifiseer. Molekulêre genetiese metodes van diagnose het nog nie 'n meer effektiewe manier om so 'n siekte as tuberkulose te erken nie. Met behulp van polimerase kettingreaksie (PCR) kan jy seker wees dat die oorspronklike DNA die aantal eksemplare in 'n miljoen keer sal verhoog, dit wil sê dat daar versterking sal wees, en dit sal die resultate kan visualiseer. Die sensitiwiteitsvlak hier is baie hoog - meer as vyf en negentig persent, wat die grootste voordeel van hierdie metode is.

Die res van die molekulêre genetiese metodes van navorsing is twee keer so effektief as duplikaatkopiëring, aangesien in hierdie geval die redaksionele steekproef toon 'n spesifieke oligonukleotiedvolgorde wat met honderd en ses keer toegeneem word. Selfs die kulturele diagnose van tuberkulose van respiratoriese organe is baie laer in sy sensitiwiteit. Daarom is moderne medisyne gebaseer op molekulêre genetiese metodes vir die diagnose van tuberkulose. En die beskryf metode is veral effektief om te voldoen aan patogene van hoë antigeen veranderlikheid, wat baie moeiliker is om te bepaal deur 'n ander metode. Spesiale voedingstowwe en lang tyd van verbouing word vereis. Biochemiese en molekulêre genetiese metodes gee heeltemal verskillende effekte.

Diagnose van tuberkulose

Hulle konstrueer PCR diagnose van tuberkulose gebruik die meeste DNS-reekse wat spesifiek is vir al vier tipes van hierdie siekte. Om hierdie doel te bereik, word primers wat sekwense van IS-elemente (IS-986, IS-6110) opspoor, die meeste gebruik, aangesien hierdie migrerende elemente slegs soorte miobakterieë van tuberkulose kenmerk en altyd teenwoordig is in verskeie afskrifte in die genoom. Ook kan DNA geïsoleer word uit suiwer kulture en klinies (sputum van pasiënte) deur enige ander aanvaarbare metode. Byvoorbeeld, daar is die Boom metode, wat gebruik maak van 'n lysis buffer gebaseer op guanidine, silika en thiocyanate as 'n draer van DNA. Die aantal pasiënte met skaars bakteriese uitskeiding styg jaar na jaar, en daarom het 'n heeltemal ander vlak van organisasie homself in die kliniese praktyk gevestig: die molekulêre genetiese metode om DNA te studeer speel 'n belangrike rol in die diagnose.

Ons moet egter erken dat dit ook nie sonder foute is nie. Die gebruik van die PCR-metode bring dikwels 'n groot aantal vals positiewe resultate, en die fout hier is nie net tegniese foute nie, maar ook die eienaardighede van die metode self. Met behulp van hierdie metode van diagnose is dit onmoontlik om die mate van lewensvatbaarheid van mycobacteria wat opgespoor word, te bepaal. Maar hierdie nadeel is nie die belangrikste nie. Molekulêre genetiese metodes van PCR diagnostiek behels die gevaar van besoedeling van mycobakteriese DNA. Sertifisering vereistes vir hierdie rede vir PCR laboratoriums is uiters rigied, hulle benodig die teenwoordigheid van drie geïsoleerde kamers. PCR tegnologie is modern en baie kompleks, die gebruik daarvan vereis voldoende toerusting en hoogs opgeleide personeel.

bacterioscopy

By die diagnose moet die resultate van die PCR-studie noodwendig met die res van die data vergelyk word: kliniese ondersoek, radiografie, smeermikroskopie, saai en selfs die reaksie op 'n spesifieke behandeling is hier baie belangrik. In hierdie reeks studies is PCR slegs een van die komponente. Ontdek die patogeen aan die begin van die diagnose kan die mees eenvoudige en vinnige metodes wees - bakteriologies.

Hier gebruik ons 'n ligmikroskoop (Tsil-Nielsen kleur) en 'n luminescerende (fluorochrome kleur). Die voordeel van bakterioskopie is die spoed waarmee resultate verkry word. 'N nadeel van dit word beskou as die beperkte moontlikhede as gevolg van lae sensitiwiteit. Hierdie metode word egter aan die WHO-aanbeveling gegee as die mees ekonomiese en basiese vir die identifisering van pasiënte met tuberkulose. Die opsporing van mikrobakterieë deur 'n bakteriologiese metode het die betekenis van 'n prognose, en bakteriese vrystelling word gekwantifiseer. Molekulêre genetiese metodes om tuberkulose te studeer, is baie meer selfvertroue daarmee.

Kultuurnavorsing

Die beste opsporing van mycobacteria word erken deur kultuurstudies. Die saai van patologiese materiaal word uitgevoer in die eiermedia: Mordovsky, Finn II, Levenshtein-Jensen en dies meer. 'N aanduiding van die ontwikkeling van weerstand van mycobacteria vir dwelms en indirekte bewyse van effektiwiteit is die hoeveelheid mycobacteria of hul kolonies in vitro indien 'n kultuurmetode van ondersoek gebruik word. Om die persentasie toekenning van mikrobakterieë te verhoog, word die patologiese materiaal gesaai vir verskeie media.

Om die talle kulturele behoeftes te bevredig, word die veroorsakende agent ook voorsien van vloeibare media. Terselfdertyd word outomatiese stelsels vir die optekening van groei van VANTES-tipe gebruik. Gewasse moet tot sewe tot agt weke geïnkubeer word. Teen hierdie tyd kan saai met 'n gebrek aan groei as negatief beskou word. Die mees effektiewe manier om mybakterie tuberkulose te identifiseer, is biologiese toetse: hulle besmet die diagnostiese materiaal van proefkinders, wat uiters sensitief is vir tuberkulose.

'N Paar figure

Die mees interessante navorsingsgebied, wat deur PCR-diagnostiek ontdek is, was die studie van M. tuberculosis, 'n latente infeksie. Die huidige konsep van tuberkulose infeksie dui daarop dat van honderd mense wat in kontak was met M. tuberkulose, negentig kan besmet word, maar slegs 10 van hulle het aktiewe siektes. Die res het antithberculous immuniteit, en dus in negentig persent van die gevalle bly die infeksie latent. Dit was die molekulêre genetiese metode wat gehelp het om hierdie patroon op te spoor.

Genetika argumenteer dat vyf-en-vyftig persent van diegene met negatiewe patologiese kulture en tagtig persent van diegene wat besmet is met M. tuberculosis, maar met 'n nie-radiografiese siekte, positiewe PCR-antwoorde ontvang het. Dit was die genetiese metode van diagnose wat gehelp het om pasiënte te identifiseer van risikogroepe wat PCR-studies gebruik, en die resultate van hul ontledings (mikroskopie en gewasse) was negatief en die subkliniese infeksie van M. tuberculosis was teenwoordig.

Moderne navorsing

Bakteriologiese laboratoriums van die Russiese Federasie gebruik 'n versnelde metode van absolute konsentrasies: die nitraatreduktase-aktiwiteit van mitobakterieë word met behulp van die Griss-reagens getoets. Anti-tuberkulosesentrums gebruik 'n metode wat dwelmweerstand bepaal. Dit is 'n gewas in vloeibare media, waar die radiometriese en fluorescerende stelsel vir die opname van die groei van mikrobakterieë geoutomatiseer word. So 'n analise word vinnig gedoen - tot twee weke.

Op die oomblik word nuwe metodes ontwikkel: die dwelmweerstand van mycobacteria word op genotipe vlak geassesseer. Die studie van die molekulêre weerstandsmeganismes toon die teenwoordigheid van gene in mykobakterieë. Hierdie gene word geassosieer met weerstand teen sekere middels. Byvoorbeeld, die gene kasA, inhA, katG is bestand teen isoniazid, rpoB tot rifampisien, 16Sp RNA en rpsL tot streptomisien, emb1 tot ethambutol, gyrA tot fluoroquinolone, en so aan.

mutasies

In moderne diagnostiek het die molekulêre genetiese vlak van die DNA-metode aansienlik toegeneem en toegelaat om grootskaalse studies van mutasies in hul hele spektrum uit te voer. Nou weet ons dat mutasies in 516, 526 en 531 kodons van die rpoB-gene die algemeenste is, en weerstand teen verskillende middels is geïdentifiseer. Daar is 'n hele reeks metodes om mybobakterieë te tik deur nie net tradisionele metodes te gebruik nie - biochemies, biologies en kultureel, maar moderne molekulêre genetiese metodes word ook wyd gebruik. Daar is reeds voldoende en betroubare diagnostiese metodes vir die opsporing van monogene siektes. Hulle is gebaseer op DNA-navorsing in die presiese streek van 'n bepaalde geen. Dit is gewoonlik 'n komplekse proses, tydrowend en duur, maar die data wat deur molekulêre genetiese analise verskaf word, is baie meer akkuraat en insiggewend as die data van alle ander ontledings.

Dit is lank reeds bekend dat DNA nie oor die hele lewe van die liggaam verander nie, maar dat dit in enige kernsel is, en dit maak dit moontlik om enige selle van die liggaam vir analise te neem, in enige stadium van ontogenie. 'N Beskadigde geen kan opgespoor word voor die voorkoms van die eerste simptome, voor die ontvoude kliniek van die siekte, en ook in gesonde heterosigotiese mense, maar met 'n mutasie in die geen. Molekulêre genetiese metodes vir die diagnose van oorerflike siektes kan geïdentifiseer word deur 'n direkte DNA-diagnostiese benadering, en ook deur die segregasie van die siekte in die familie te analiseer met merker DNA-loci (polimorfiese terreine) wat nou verband hou met die beskadigde gene (dws 'n indirekte DNA-diagnose-benadering). Direkte of indirekte - enige DNA-diagnose is gebaseer op metodes wat 'n streng gedefinieerde gebied van menslike DNA identifiseer.

Direkte metodes

Direkte metodes van DNS-diagnose word gebruik in gevalle waar die geen-skuldige van die oorerflike siekte bekend is, en die tipes van sy mutasies is ook bekend. Byvoorbeeld, direkte metodes is geskik vir 'n verskeidenheid siektes. Dit is Huntington se chorea (uitbreiding van CTG herhalings), fenylketonurie (R408W), sistiese fibrose (delF508, groot mutasie) en dies meer. Die grootste voordeel van die direkte metode is 'n honderd persent akkuraatheid van die diagnose, en daar is geen behoefte om 'n DNA-analise van die res van die familie te doen nie. As 'n mutasie in die ooreenstemmende geen gevind word, kan jy die diagnose van oorerflikheid akkuraat bevestig, die genotipe vir die res van die lasgewende familie bepaal.

Nog 'n voordeel van direkte diagnose is die identifisering van heterosigotiese vervoer van slegte mutasies in familie en ouers van die oorledene van die siekte. Dit geld veral vir siektes van outosomale resessiewe. Nadele van direkte metodes is ook beskikbaar. Om dit toe te pas, moet u die lokalisering van die patologiese geen, die ekson-intronstruktuur en die spektrum van sy mutasies presies weet. Nie alle monogene siektes het vandag sulke inligting ontvang nie. Die informativiteit van direkte metodes kan nie as volledig beskou word nie, aangesien dieselfde geen 'n groot aantal patologiese mutasies kan hê, wat die ontwikkeling van oorerflike siektes bepaal.

Indirekte metodes

Indirekte metodes in DNS-diagnostiek word in ander gevalle gebruik: as die beskadigde geen nie geïdentifiseer word nie, maar slegs op die chromosoom gelokaliseer is, of as direkte diagnose nie resultate opgelewer het nie (dit gebeur as die geen 'n komplekse molekulêre organisasie of 'n aansienlike lengte het as daar baie daarin is Patologiese mutasies). Indirekte metodes word gebruik om die segregasie van polimorfiese merkers in die familie van allele te analiseer. Merkers is in dieselfde chromosomale gebied of is nou gekoppel aan die lokus van die siekte en verteenwoordig afwykings of invoegings, puntvervangings, herhalings, en hul polimorfisme is te danke aan verskillende getalle in die element blok.

Die mees gerieflike vir indirekte diagnose is mikrosatelliet- en minisatelliet-polimorfiese merkers, wat wyd versprei word in die menslike genoom. Hul waarde word uitgedruk in hoë informativiteit, indien die genetiese afstand tussen die skade in die geen en die merker nie te groot is nie. In laasgenoemde geval word die akkuraatheid van die evaluering in groot mate bepaal deur die frekwensie van rekombinasie tussen die polimorfiese merker en die skade. Indirekte metodes van diagnose maak ook voorsiening vir 'n verpligte voorlopige stadium van die studie van die allele frekwensie van die geanaliseerde populasies onder die draers van mutasies en pasiënte, plus die behoefte om die waarskynlikheid van onewewig en rekombinasie van die adhesie van merkers en mutante allele van die geen te bepaal.

Ander metodes

Kort segmente van RNA of DNA, sowel as 'n enkele geen kan nie deur mikroskopiese ondersoeke gesien word nie. Om sodoende mutasies te identifiseer, is molekulêre genetiese diagnostiekmetodes nodig. Die bestaande "Human Genome Project", soos ander prestasies in molekulêre genetika, het op vele maniere die moontlikheid uitgebrei om die oorerflike siektes te diagnoseer - beide voor- en postnatale. Hierdie metodes kan vroegtydige opsporing verskaf en 'n voorspelling maak van poli- en monogene siektes, waarin die debuut in volwassenheid voorkom. Ongelukkig gaan molekulêre genetiese studies soms in terme van tegniese vermoëns verder as die etiese raamwerk wat met betrekking tot oorerwing vasgestel word, veral wanneer die diagnose in adolessensie en kinderjare uitgevoer word.

Strukturele en numeriese chromosomale abnormaliteite is die mees algemene oorsake van siekte en kanker, en baie misvorming. Chromosoommutasies moet geïdentifiseer word, wat belangrik is vir 'n familie berading - die voorspelling te evalueer, saam met reproduktiewe risiko in toekomstige swangerskappe. Chromosoom analise is die "goue standaard" van genetiese diagnose, maar dit is beperk. Slegs die metodes van molekulêre genetiese analise kan meer doen nie, omdat daar gebruik kloning tegnologie gebaseer fluorescent etikette in staat hul hoë sensitiwiteit vir subtiele chromosomale veranderinge wat onmoontlik is om klassieke spoor te identifiseer sitogenetiese studies. Hierdie tegnieke is steeds die uitbreiding van ons diagnostiese vermoëns, toe ondersoek, kinders met ontwikkelings gestremdhede, verstandelike gestremdheid, met baie ander oorerflike siektes.

bevindings

Dit is baie belangrik vir die mensdom was die gene struktuur en funksie van kennis, tipes van variasie, die vermoë om oorerflike siektes wat plaasgevind het in verband met die ontwikkeling van molekulêre genetika op te spoor. sy metodes is daarop gemik om die studie van die DNA molekule - en wanneer dit is normaal, en wanneer dit beskadig. Voorbereiding van deoksiribonukleïensuur rye van nukleotiede (DNA) strek in stadiums van die ontvangs van monsters om individuele fragmente te identifiseer. Isolasie van genomiese DNA van die selle, beperking (skeur), versterking (kloning), elektroforese van die fragmente (skei hul elektriese lading en molekulêre gewig deur agarose gel). Identifisering van spesifieke fragmente geleë op die oppervlak van 'n diskrete streep.

Dan kry in die Wet op spesiale filters, waardeur gaan elke fragment verbastering met gekloonde DNA-fragmente of sintetiese radio-aktiewe probes is 'n beheer, wat gelyk is aan elke toets monster sal wees. As jy die posisie of lengte verander in vergelyking met die ondersoek, as 'n nuwe fragment of verdwyn - dit alles dui daarop dat die ontleed gene ondergaan herstrukturering in die nukleotiedvolgorde. Daar is agt basiese tegnieke van molekulêre genetiese studies: volgorde (bepaling van DNA volgorde), polimerase kettingreaksie (toename in die aantal rye), die voorbereiding van primers bekend gene, DNA kloning, produksie van rekombinante molekules afgelei proteïene as gevolg van rekombinante molekules, die skep van 'n volledige stel (versameling biblioteek) gekloon fragmente wat verkry word deur die gebruik van beperking.